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細胞培養的成功跟細胞消化有關嗎?

 二維碼 447

細胞培養的成功跟細胞消化有關嗎?

導讀

因為一些特殊的原因,培養接觸過近300種細胞,常用于做實驗的,累積有百余種,可以說遇到過各式各樣古怪的細胞。這里挑細胞消化做一篇專題,并不是因為細胞消化最重要,而是近期看到大家頻繁討論這個話題,我就拋磚引玉,下面幾點拙見,可能與其它朋友總結的一些經驗有點出入,僅供大家參考。

細胞消化的一般程序步驟,細節操作,我這里就不講了,只講一些基本操作背后的知識,如有不妥之處,歡迎指正,一起討論:



1. 絕大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后,殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞(絕大部分1min不到)。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續這樣傳代,對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后37℃消化。


2.怎么樣算是消化好了呢?不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細胞層,只要能移動了,多半呈沙壯移動,其實已經可以了,很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完全分離細胞,這是沒有必要的。一般能移動了,說明細胞與培養基質材料的附著已經消失了,細胞之間的附著也已經消失了,細胞已經獨立分布了(雖然沒有呈現很廣的離散分布)。這個時候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。細胞就是完全成單個細胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會聚集,這個是貼壁培養的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個特性,無論死活的細胞都是如此,你可以嘗試,準備100%的單個細胞懸液,貼壁后觀察細胞,仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。一些懸浮培養細胞也是如此,容易聚集,不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液(不要笑,這個是初養懸浮細胞的人常犯的錯誤,以為懸浮培養就是一個一個分開)。細胞只要能從基質上脫離下來,這個時候即使是成片的(比如Calu-3細胞),吹打不超過20次后(一般10次即可),成小規模聚集(10個細胞左右),是正常的,不要試圖再去延長消化時間,或者象有的同學那樣吹打1h,等待單細胞懸液出現。


3.另一個帖子里提到一個比較復雜的四步消化法,這個挺有意思,我也是第一次聽說,應該是網友自己發展出來的方法,很有參考價值。但我估計這個方法可能對付少數非常怪異的細胞才需要這么復雜的程序。我目前養過的近300株細胞里面,還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實是很好消化的細胞,不需要胰酶孵育即可,只是有點成片分布。不要以為成片分布是自己沒養好,這個視細胞而定。如果和標準形態不一致,那可能是自己沒消化好導致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至完全吹打成單細胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細胞的特性,是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細胞之后會對你越來越不好。


4.比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),就以coloncancer為例,比如HCT15,LS411和KM12,這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100mm dish,一次最多加入500ul,就足夠了,一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞,一般不超過5min,即可見細胞成片移動,就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候,比如tsDC細胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動。


5.常規的細胞實驗(增殖,凋亡,遷移,分化之類的),受消化影響不是很大,如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化(難消化細胞例外)即可。但少數實驗,比如病毒包裝,對細胞代數,對細胞狀態要求極高。這個時候,胰酶消化,就是潤洗,都會對細胞包裝病毒的能力有影響,傳代次數一多,細胞包裝能力就會逐漸下降(當然也有其它因素影響包裝效率)。這個時候都不用胰酶消化,用一些鹽溶液(不是EDTA液)即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關酶的活性,來使得細胞脫離基質附著表面,但不切割任何蛋白。


6.EDTA的作用。許多人不用胰酶,只用EDTA,或者用trypsin/EDTA聯合作用。這里要明白,trypsin切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白,而EDTA通過螯合Ca離子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA,或者對付特別難消化的細胞,添加多一些EDTA,就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間(如果10min還消化不徹底的話),而應該想其它辦法。


7.PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌,是常見的操作,因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學問可以講,對于一些難消化細胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞,不需要配制如此溶液。


總結下來,雖然這篇文章是關于消化的,但其實消化并不是細胞培養的關鍵所在(雖然很重要),關鍵所在是細胞來源,血清質量和水源(自己配制溶液的話)。我看到版上許多人養細胞遇到各種各樣的問題,很多時候bottleneck沒有找到,雖然通過其它方法有所改善,但仍然是事倍功半。因為人們往往注意自己的操作,總覺得自己沒有經驗,而忽視試劑,溶液尤其是細胞的質量,后者其實才是許多細胞培養實驗室常見的問題。

1分辨血清來源,切勿上當受騙由于瘋牛病的原因,到目前為止我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等有疫情的地區進口牛血清,因此市面上的牛血清大多來自澳洲SAFC牛血清的血源,Corning的澳洲胎牛血清的血源就是來自澳洲嗒)、南美洲,或是國產的。至于來源于巴西的、以色列的血清,大家還是看看就好,切莫隨意行動。

2嚴查生產質檢,減低批間差別血清批次間的差別是不可避免的,這種差異來源于不同的制備方法和除菌方法、動物的年齡差別、血清的儲存條件、動物的來源等。因此血清的生產、過濾、消毒、質檢流程的嚴格控制以及長期穩定的血清供應更顯的尤為重要,這一點國產的很多血清就望塵莫及啦。


文章分類: 行業新聞
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